|
|
Материалы |
|
|
Вопросы к экзаменам 9
семестра ОСНОВНЫЕ
ПРИНЦИПЫ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА (Г.М.Казанков) Механизм сорбции молекул и
ионов на активном центре. Водородная связь, электростатические взаимодействия,
гидрофобные взаимодействия, комплексы с переносом заряда и оценка их вклада в
сорбцию субстрата на ферменте. Коиформациоииыс изменения в структуре белка и
лиганда, сопровождающие сорбцию. Оценка свободной энергии сорбции
(экстракционная и экстракционно-конформационная модели). Свободная энергия сорбции
субстрата на ферменте как источник ускорения химической реакции. Профили
"свободная энергия - координата рсацни". Оценка масштабов исличипы
свободной энергии сближения реагентов. Сравнение, скорости и свободной
энергии ферментативной и неферментативной реакции, модель
"ключ-замок". Специфическое, продуктивное и непродуктивное
связывание субстрата и фермента. Механизм сближения и ориентации в
ферментативном катализе. Теории напряжения (или деформации) и индуцированного
соответствия (Коштланд). Химические механизмы
ферментативных реакций. Стабилизация переходного состояния общим
кислотно-основным катализом. Примеры кислотно-основного катализа различными
функциональными группами в белках (карбоксильная группа, аминогруппа, амидная
группа, имидазол, гидроксильная группа), механизмы эстафетной передачи заряда
и "push-pall". Промежуточные
ковалентные соединения в ферментативном катализе. Эффекты микросреды
активного центра. Влияние растворителя на реакции нуклеофильного замещения,
внутренняя реакционная способность функциональных групп в белках. Роль ионов металлов в
ферментативном катализе. Взаимосвязь координационного .числа и геометрии
комплекса, примеры комплексов металлов с различной геометрией в биологаческих
системах. Устойчивость комплексов, влияние на нее заряда и размера иона,
"жесткости" и "мягкости" центрального атома и лиганда,
основности лиганда, хелатного и макроциклического эффектов.
Комплексообразование ионов металлов с белками. Механизмы взаимодействия
фермента, иона металла и лиганда. Химические механизмы участия ионов металлов
в фрментативном катализе. Окислительно-восстановительные реакции с участием
ионов металлов и их роль в биологических процессах. Коферменты.
Окислительно-восстановительные коферменты: NAD, FAD, кобаламины и кобаламиды
(витамин b]),
аскорбиновая
кислота, ферридоксин (структура и механизм действия). Коферменты, не
обладающие окислительно-восстановительными свойствами: тиаминпирофосфат,
пиридоксальфосфат, тетрагидрофолиевая кислота, биотип, кофермент А (структура
и механизм действия). ОБЩАЯ
МИКРОБИОЛОГИЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА 1.Место микроорганизмов в
природе (животные, растения. протисты). Общие свойства микроорганизмов,
(размеры, особенности метаболизма, высокая скорость размножения и т.д.). 2.Строение
прокариотической клетки (отличия от эукариотической). 1)Плазматическая мембрана,
клеточная стенка, ядерный аппарат, рибосомы, фотосинтетические ламеллы,
включения. 2)0сновные морфологические
группы бактерий. 3.Клеточная
стенка грамположительных и грамотрицательных бактерий. Строение муреинового
слоя. Механизм действия лизоцима и пенициллина. Протопласты и сферопласты. 4.Питание и рост
микроорганизмов. 1) Потребность в
химических элементах (макро- и микроэлементы). 2)Источники углерода и
энергии (автотрофные и гетеротрофные микроорганизмы). Факторы роста (понятие
ауксотрофии). 3) Отношение к кислороду
(облигатные, -факультативные аэробы, анаэробы). Аэрация (способы увеличения
поверхности раздела между газовой и жидкой фазами). Анаэробные культуры.
Техника Хангейта. 5.Питание и рост
микроорганизмов. 1)Питательные среды
(синтетические, сложные, твердые и т.д.). 2)Отношение к концентрации
ионов водорода. 3 Отношение к температуре
(мезофильные, термофильные и психрофильные микроорганизмы). 4)Селективные методы
культивирования. Получение накопительных культур. Чистая культура. Смешанная
культура. 6.Физиология роста
микроорганизмов. 1)Основные
понятия (концентрация и плотность бактерий, константы скорости деления и
роста, время генерации и удвоения). 2)Методы
определения числа бактерий (общее число клеток, число живых клеток). 3)методы
определения бактериальной массы (прямые и косвенные). 4)Кинетическое
описание экспоненциального роста. 7.Физиология
роста микроорганизмов. 1)Рост
бактерий в периодической культуре. Характеристика фаз кривой роста
бактериальной культуры. Параметры кривой роста (урожай, скорость роста,
длительность лаг-фазы) 2)Рост
в непрерывной культуре. Характеристика роста в хемостате. Различие между
периодической и непрерывной культурами. 3)Синхронизация
клеточного деления. 8.Подавление роста и гибель микроорганизмов.
Бактериостатическое и бактерицидное действие различных агентов. Действие на
поверхностные структуры клетки (этанол, детергенты и т.д.). Дезинфекция.
Ферментные яды. Механизм действия сульфониламидов,.антибиотиков
(хлорамфеникол, пенициллин, стрептомицин). Методы
стерилизации. Техника безопасности при работе с микроорганизмами. 9.Основные типы брожений, вызываемые
микроорганизмами. Понятие брожения как способа регенерации АТФ. Основные
реакции фосфорилирования. Характерные конечные продукты различных брожений. 10.Спиртовое
брожение, вызываемое дрожжами и бактериями. Общая схема. Применение дрожжей в
пищевой промышленности. 11.Молочнокислое
брожение. Общая схема. Основные представители (гомо- и гетероферментативное
брожение). Применение и распространение молочнокислых бактерий. 12.Пропионовокислое
брожение. Краткая характеристика пропионовокислых бактерий, их использование
в сыроделии. Маслянокислое
и ацетоно-бутиловое брожения. Краткая характеристика бактерий родов Bacillus
и Clostridium. 13.Муравьинокислое
брожение. Основные роды бактериий. осуществляющие брожение по этому пути.
Патогенные представители. Светящиеся бактерии. 14.Анаэробное
дыхание (нитратное, сульфатное, серное, карбонатное). Соответствующие
неорганические акцепторы электрона. Значение бактерий в круговороте веществ в
природе. 15.Нуклеиновые
кислоты: первичная и вторичная структуры. Репликация ДНК. Транскрипция.
Трансляция. Способы реализации генетической информации. Генетический код. 16.Обмен
генетической информацией между микроорганизмами в природе.
Трансформация. Трансдукция. Трансмиссия (конъюгация). > 17.Модификация
нуклеиновых кислот.Системы рестрикции-модификации ДНК и их роль в природе.
Репарация ДНК. 18.Строение
генома бактерий. Хромосома. Плазмиды. их классификация (группы
"несовместимости"), регуляция копийности. 19.Понятие
"ген". 20.Генетическая
основа эффективных экспрессирующих систем рекомбинантных белков E.сoli. МЕТОДЫ
ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛКОВ (А.К.Гладилин) 1. Иммобилизация белков
(ферментов). Общие определения. Преимущества иммобилизованных препаратов
биокатализаторов. Типы иммобилизации. 2. Носители для
иммобилизации белков (ферментов). Классификация. Приемы активации носителей. 3. Физическая иммобилизация. Сравнительный анализ типов физической
иммобилизации. 4. Химическая
иммобилизация. Выбор групп-мишений (белка) для иммобилизации. Химические
реакции, приводящие к созданию связей белок-носитель. Области применения
химически иммобилизованных белков (ферментов). 5. Кинетические
закономерности катализа иммобилизованными ферментами. Конформационное
состояние иммобилизованного фермента. Эффекты распределения компонентов
системы с иммобилизованными ферментами. Понятие о кинетическом и диффузионных
режимах протекания ферментативной реакции. 6. Стабильность
иммобилизованных ферментов. Обратимая денатурация и необратимая инактивация
ферментов. Механизмы стабилизации ферментов иммобилизацией. 7. Фибриллярные белки. Кератин и фиброин. 8. Коллаген. Формирование коллагена. Прото- и тропо-коллаген.
Элластин. 9. Миозин и актин. Структура и функции. Протеогликаны. 10. Спектроскопические методы исследования белков. Общие положения.
Абсорбционная спектроскопия (интегральная и дифференциальная). Эмпирические
правила. 11. Спектроскопические методы исследования белков. Общие положения.
ИК- и КР-спектроскопия. Эмпирические правила. 12. Спектроскопические методы исследования белков. Общие положения.
Флуоресцентная спектроскопия. Поляризация флуоресценции. Эмпирические
правила. 13. Спектроскопические методы исследования белков. Дисперсия
оптического вращения и круговой дихроизм. Эмпирические правила. СТРУКТУРА АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ И
МЕХАНИЗМЫ> ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ (Н.Л. Клячко) 1. Классы ферментов. Номер фермента. Примеры катализируемых
ферментами реакций. 2.
Основные функциональные группы активных центров ферментов. Примеры. 3.
Связывание субстрата в активном центре фермента. Основные группы активного
центра, участвующие в связывании. Основные типы и примеры взаимодействий
фермента и субстрата. 4.
Кофакторы, коферменты и простетические группы ферментов. Примеры. 5.
Роль ионов металлов в катализе. Примеры. 6. Гидролазы. Особенности структуры
активного центра и механизм действия а-химотрипсина. 7. Гидролазы. Особенности строения
активных центров, сходные черты и различия в катализе α-химотрипсином,
трипсином, эластазой. 8. αХимотрипсин. Особенности взаимодействий в
фермент-субстратном комплексе и переходном состоянии. 9. Клеточная стенка бактерий и
гликозидазы. Лизоцим, группы активного центра, особенности механизма
действия. 10.
Кислые протеазына примере пепсина: особенности строения активного центра и
механизма действия. 11.
Тиоловые протеазы на примере папаина: особенности строения активного центра и
механизма действия. 12.
Особенности строения активного центра карбоксипептидазы А, альтернативные механизмы действия фермента. 13.
Рибонуклеаза: основные группы активного центра, типы катализа. 14. Специфичность ферментов: групповая, абсолютная,
стереоспецифичность. Примеры. 15. Гем-содержащие белки и ферменты.
Особенности строения. Основные окислительные состояния железа гема. 16.
Гем-содержащие белки и ферменты. Гемоглобин и миоглобин, особенности строения
и функции. 17. Гем-содержащие ферменты на примере
пероксидаз: особенности структуры, механизм расщепления пероксида водорода в
активном центре. 18.
Ионы металлов в катализе. Карбоангидраза: особенности строения , активного
центра (рН-зависимость и рК групп, участвующих в катализе), механизм
действия. 19.
NAD+-зависимые ферменты, особенности строения кофермента, перенос
гидрид-иона. Пример катализируемой ферментом реакции с участием NAD+'
(NADH). 20.
Структура активного центра и механизм действия алкогольдегидрогеназы. 21. Особенности взаимодействия с
субстратом и механизм действия лактатдегидрогеназы. 22. Флавопротеины. Особенности строения FMN и FAD,
участие в катализе глутатионредуктазой. 23.
Тиаминпирофосфат: особенности строения, участие в катализе на примере
пируватдекарбоксилазы. 24. Пиридоксальфосфат: особенности
строения, участие в катализе на примере рацемазы аминокислот. 25. Пиридоксальфосфат: особенности
строения, образование и роль основания Шиффа (На примере реакции,
катализируемой аминотрансферазой). АНАЛИТИЧЕСКАЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ (Н.Н.Угарова) 1. Кинетические основы
ферментативных методов анализа. Классификация 'кинетических
методов анализа. Дифференциальные
методы; метод начальных скоростей, метод фиксированного времени, метод варьируемого
времени. Интегральные методы. Метод конечной точки. Особенности использования
индикаторных реакций первого н второго порядка. Калибровочные кривые,
уравнение калибровочных кривых. метод внутреннего стандарта. 2. Использование ферментов в качестве
аналитических реагентов, Преимущества ферментов как
аналитических реагентов специфичность, высокая каталитическая активность,
многообразие определяемых веществ. Основные требования к современным методам
анализа; правильность, низкие пределы обнаружения, экспрессность. Методы определения субстратов и.
ферментов. Активация и ингибирование., Аналитическое использование эффекта
активации. Определение катализатора, активатора. ' Различные классы ингибиторов ; .ферментов
и особенности их ферментативного определения. Сопряженные полиферментные
системы в анализе. 3. Основные методы индикации cкоpocmи ферментативных реакций и индикаторные
соедцнения и ферменты в анализе. Понятие об электрохимических,
спектрофотометрических, флуорометрических, хемилюминесцентных,
биолюминеоцентных методах детекции. Основные индикаторные продукты
ферментативных систем; О2, Н2О2, NH3, НАД(Ф)Н2, АТФ, ФМН Н2 и сравнение различных методов их
детекции. Основные классы ферментов, наиболее часто используемые в анализе:, оксидазы, дегидрогеназы,
пероксидаэы, протеазы, люцифераы, эстеразы. Основные метаболиты и способы их
ферментативного определения: аминокислоты, мочевина и ее производные, сахара,
спирты, липиды. 4. Иммобилизованные
ферменты в анализе. Реакторы с иммобилизованными ферментами;
колонки, трубки, реакторы с полыми нитями, мембранные реакторы. Детектирующие
системы с иммобилизованными ферментами и биосенсоры. Оптоволоконные
детекторы. Электроаналитические 'датчики; ферментные электроды, биочипы.
Термисторы. Преимущества ферментных детектирующих сис-тем. Проблемы
стабильности ферментных датчиков и правильности их работы: чувствительность;
соотношение сигнал-шум, время ответа. Различные методы регистрации и
обработки аналитических данных. 5.
Биолюминесценция и биолюминесцентныи
анализ. Основные хеми- к биолюминесцентные
системы: люциферазы светляков и бактерий, люминол-пероксидава. Аналитические
возможности этих систем, их преимущества. Принципы определении АТР и
использование АТР-метрии в "быстрой" микробиологии, контроле бактериаль-ных
загрязнений в биологических образцах, пищевых продуктах, воде. Определение
адениновых нуклеотидов. Биолюминесцентные методы определения ферментов
(креатинкиназа), антибиотиков. Биолюминогенные субстрат ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ, ОСНОВЫ
ИММУНОЛОГИИ (А.П.Осипов) 2. Физико-химические закономерности взаимодействия антиген-антитело.
Методы определения аффинности антител. Равновесный диализ. Методы
фракционного осаждения. Методы расчета физико-химических параметров реакции
антиген- антитело. 3. Кинетические харакгерисгики взаимодейс-гвия антиген-антитело.
Экспериментальные методы определения кинетических констант. Определение
скоростей комплексообразоваиия с использованием меченых реагентов.
Определение константы скорости ассоциации. Определение константы скорости
диссоциации. 4. Ферменты как метки в иммуноанализе. Основные физико-химические и
кинетические свойства ферментов. Физико-химнческие свойства ферментов,
используемых в ИФА. Пероксидаза хрена. Щелочная фосфатаза. Фотометрические,
флуоресцентные, хемилюминесцентные субстраты. 5. Получение антисывороток.Структура иммуногена. Адъюванты. Выбор
вида животного. Способы иммунизации. Практические процедуры иммунизации и
получение антисыворотки. Тестирование антисывороток. Моноклональные антитела. 6. Методы получения конъюгатов для ИФА- Получение конъюгатов
носителей с гаптенами с карбоксильной группой. Получение конъюгатов.
белок-фермент. Перйодатный метод Накане. Гомобифункциональные сшивающие
агенты. Получение конюъгатов с помощью глутарового альдегида, п-безохинона,
малеимидный метод. Гетеробифункциональные сшивающие агенты. Получение
конъюгатов с помощью активированных эфиров малеимидных соединений. Получение
конъюгатов с помощью пиридилсульфидного метода. Получение конъюгатов
гаптен-фермент. Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими
карбоксильную группу. Метод смешанных ангидридов. Карбодиимидный мегод.
Получение конъюгатов гаптенов с ферментами, содержащими аминогруппы. Методы с
применением гомо- и гетеробифукциональных сшивающих реагентов. 7. Методы иммуноанализа. без использования меченых реагентов. Методы
иммуноанализа, основанные на использовании меченых реагентов.
Радиоиммунологический анализ. Методы иммуноферментного анализа (ИФА) и их
сравнение. ИФА с использованием меченного ферментом антигена. Конкурентный
анализ. Метод двойных (вторичных) антител. Метод последовательного насыщения.
Методы с использованием меченых специфических антител. Конкурентный анализ с.
иммобилизованным антигеном. Сандвич-метод. Методы с использованием меченых '
антивидовых антител. Твердофазный ИФЛ с использованием нсковалентных комплексов
фермента-маркера с антителами. Твердофазный анализ в проточных системах. 8. Теоретические основы ИФА. Закономерности
конкурентного анализа. Закономерности сэндвич-анализа. Длительность анализа,
предел обнаружения. 9. Биосенсорные устройства, основанные на
различных методах детекции. Электрохимические биосенсоры. Полупроводниковые
биосенсоры. Оптические квантовые системы (поверхностный плазменный резонанс,
, диффракционные решетки, эффект полного отражения и т.д.) Амплификационные системы
преобразования сигнала. 10. Флуоресцентный анализ. Флуоресцентный
иммуноанализ с разрешением во времени, типы используемых меток, типы
проведения анализа. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ. 11. Методы представления и обработка
экспериментальных данных. Калибровочные графики. Стандартное отклонение,
стандартная ошибка, коэффициент вариации, доверительный интервал. |
|
|
Идея и реализация проекта –
Динара Зубаерова |
